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蛋白抽提和定量方法

2018-06-05 永利yl8886官方网站
细胞样本生长至一定密度的细胞,弃去培养基后,用胰酶消化后用预冷的PBS清洗三遍,或细胞清洗后直接在细胞培养皿上用SDT裂解液裂解
组织样本新鲜摘取的动物/人体组织需预先在PBS中漂洗,彻底清除明显的血液与血丝;收集后的组织样本在液氮中速冻,再转移到-80℃长期保存,送样时干冰运输。
1. 组织加入适量SDT裂解液,用组织均匀器(钢珠或陶瓷珠)、研钵、或者超声等方法,裂解组织,至无肉眼可见的组织块为止。
2. 95度煮样5-10 min,12,000 g离心10 min,弃上层油脂和下层沉淀等,中间澄清部分吸出转移。
3. 蛋白质定量(基于色氨酸的荧光定量方法)和SDS-PAGE确定样本蛋白量和样本质量(是否有降解或者高峰度蛋白污染等)
4. 确定样本质量过关,进行质谱实验。
 
蛋白定量方法
SDT 裂解液中有SDS,SDS在其它定量方法中有吸光值。内源荧光法,基于蛋白质中含色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,能吸收270-300 nm的紫外光而发出紫外荧光。当用280 nm波长激发时,蛋白有大致相同的荧光光谱,其中酪氨酸最大吸收在313 nm,色氨酸最大吸收在350 nm,苯丙氨酸与酪氨酸类似。
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